Výskyt fumonisinů v potravinách na bázi kukuřice v České republice

V letech 1995 a 1996 bylo vyšetřeno v České republice 210 vzorků potravin na bázi kukuřice na obsah fumonisinů. K analýze fumonisinů byla využita imunochemická metoda ELISA. 89% vzorků bylo pozitivních na obsah fumonisinů v rozsahu 9 - 4594 ( aritm. průměr 180 ng/g ). U 4 % vyšetřovaných vzorků byly stanoveny koncentrace fumonisinů více než 1000 ng/g. Maximální koncentrace fumonisinů byly stanoveny ve vzorku kukuřičného křehkého chleba (max 4594 ng/g), extrudovaných kukuřičných výrobků (max 1178 ng/g) ve vzorku polenty (max 1243 ng/g). Corn flakes (max 328 ng/g), pop corn (max 128 ng/g), corn snack (max 32 ng/g) patří k potravinám, kde byly stanoveny poměrně nízké koncentace fumonisinů. Nejvyšší odhad expoziční dávky je možno očekávat z kukuřičné mouky 0.428 µg/osobu/den (aritm. průměr naměřených hodnot) a polenty 0.280 µg/osobu/den (aritm. průměr naměřených hodnot). Nižšší odhady expoziční dávky fumonisinů je možno očekávat z pop cornu, corn snacku a cornflakes.

Mykotoxiny fumonisiny se stávají v posledních letech předmětem odborného zájmu řady výzkumných týmů ve světě, ale i u nás. Fumonisiny patří do skupiny fusariových mykotoxinů. V současné době bylo izolováno 7 fumonisinů: B₁, B₂, B₃, B₄, A₁, A₂, C₁. V přírodních podmínkách se nejčastěji vyskytují fumonisiny B₁, B₂, B₃. Nejvýznamnější z nich jsou fumonisiny B₁ a B₂ ( dále FB₁ a FB₂ ) ^{(8, 9, 16)}.
Fumonisiny jsou produkovány některými mikroskopickými houbami rodu Fusarium sekce Liseola (F. moniliforme, F. proliferatum, F. anthophilum dále F. dlamini, F. napiforme, F. nygamai, F. oxysporum ) a rodu Alternaria (Alternaria alternata var. lycopersici). Anamorfní rod Fusarium produkuje vedle fumonisinů řadu dalších mykotoxinů (např. trichotheceny, fusarin C, zearalenon, moniliformin) a biologicky aktivní produkty (např. gibereliny) ^{(4, 15, 16)}.

Nejvýznamnějším zdrojem fumonisinů je kukuřice a potraviny a krmiva na bázi kukuřice. Fumonisiny mohou být stanoveny i v kukuřici dobré jakosti. Výskyt reziduí fumonisinů v potravinových surovinách živočišného původu po konzumaci krmiva kontaminovaného fumonisiny hospodářskými zvířaty, je možný u reziduí fumonisinů v mléce a pravděpodobný ve vepřových ledvinách a játrech ^{(4, 27, 31)} .

Fumonisiny jsou podle IARC/FAO/WHO klasifikovány jako možné karcinogeny pro člověka (třída 2B). Na základě studií z Číny a z Transkei se diskutuje otázka možného podílu vysokých dávek fumonisinů v etiologii nádorů jícnu lidí ^{(6, 30, 36)}. Fumonisiny (mimo FA₁ a FA₂) jsou promotory karcinogenního procesu, nevykazují však genotoxické a mutagenní účinky na dosud zvolených modelech a jsou cytotoxické pro řadu savčích a ptačích buněk ^{(10, 17)}. Experimentálně byly testovány toxické účinky fumonisinů na řadě hospodářských i laboratorních zvířatech. Bylo zjištěno, že může způsobovat řadu onemocnění (leukoencephalomalacii koní, plicní edém prasat, duodenitis et proximal jejunitis syndrom u koní a nádorové onemocnění jater laboratorních krys). Fumonisiny jsou fytotoxické pro některé plevele i kulturní plodiny ^{(5, 10, 12, 13, 19, 21)}.

Fumonisiny jsou prokazovány nejčastěji chromatografickými metodami (HPLC, HPLC - MS-MS, GC-MS, TLC) ^{(2, 9, 25-28, 36)} a imunochemickými metodami ^{(1, 2, 3, 24, 29, 32)}. Vzorky kukuřice lze čistit metodou separace na pevné fázi (SPE), imunoafinitní chromatografií a v poslední době byla použita i metoda superkritické fluidní extrakce (SCE) ⁽²⁵⁾.

MATERIÁL A METODA

Zdroj vzorků

210 vzorků potravin na bázi kukuřice bylo získáno v letech 1995 a 1996 nákupem v obchodní síti v ČR. Vzorky byly rozděleny na 10 typů potravin: kukuřičný křehký chléb, extrudované kukuřičné výrobky (křupky, tyčinky, perličky), Pop Corn, Corn flakes, kukuřičná mouka, kukuřičná kaše, kukuřičné těstoviny, polenta, Corn snack, a jiné kukuřičné potraviny (např. sterilovaná kukuřice v nálevu, kukuřičný nápoj)

Vzorky byly po odběru uchovány do doby analýzy při teplotě -20°C.

Analytická metoda

Pro stanovení fumonisinů byla použita imunochemická metoda ELISA (Ridascreen^® Fumonisin Fast, Art. No R3403, R-Biopharm GmbH, Darmstadt, Germany, SRN). K přípravě vzorků byla použita modifikovaná metodika doporučená výrobcem. Mez stanovitelnosti byla stanovena výrobcem soupravy na 9 ng/g a mez detekce na 0.2 ng/g. Variační koeficient opakovatelnosti činil 7% na úrovni 50 ng/g. Typické křížové reakce byly stanoveny u fumonisinu B₁, B₂ a B₃ (100%, 40% a 100 %). Výtěžnost fumonisinu B₁ byla stanovena na úrovni 50 ng/g 59.7% a na úrovni 500 ng/g (73%) ⁽²⁸⁾. V naší studii jsme stanovili výtěžnost 70% na úrovni 300 ng/g a rozsah stanovení metody, daný kalibrační křivkou, byl 9 - 5625 ng/g.

Z hlediska zabezpečení jakosti práce (QA/QC) není zatím k dispozici certifikovaný referenční materiál (je v současné době v přípravě) a ve světě se zatím nepořádá testování způsobilosti laboratoří pro tento typ analytu ⁽³³⁾. Pro potřeby zabezpečení jakosti laboratorních výsledků byl námi použit testovací materiál, kukuřičná mouka se známými hodnotami fumonisinu B₁ a B₂, který byl laskavě poskytnut v US FDA, Washington D.C. (v laboratoři CFSAN Mrs. Mary W. Trucksees)

Fumonisin B₁ (CAS 116355 -83-0) pro přídavky do vzorků byl použit FB₁ od firmy Sigma - Aldrich, Prague, CZ. Safety notice: Fumonisins are suspected carcinogens a should be haled with care.

Extrakce vzorků kukuřice

Vzorek (5 g) byl extrahován s 10 ml (pro kukuřici) nebo 30 ml (pro extrudované kukuřičné výrobky) směsi metanol/voda (75/25), 5 min na homogenizátoru Polytron PT - 3000 (Kinematika, Švýcarsko).

Extrakt byl odstředěn 15 min při 3000 g. Supernatant byl ředěn 1:7.5 pufrem PBS. Alikvotní podíl extraktu byl naředěn 1:3 v 10% směsi metanol/pufr PBS a přímo aplikován do testu.

Vyhodnocení výsledků

K vyhodnocení testů byl použit fotometr MRX 1200 (fy Dynatech Laboratories). Měření probíhalo při 450 nm. Výsledky měření byly zpracovány pomocí programu SILAB (fy SIMPO, Slovensko). K statistickému vyhodnocení výsledků byl použit program QUATTRO - PRO WINDOWS (version 5.0).

VÝSLEDKY A DISKUSE

V letech 1995 a 1996 bylo vyšetřeno 210 vzorků potravin na bázi kukuřice (výrobky z kukuřičné mouky, cornflakes, pop corn, polenta atd.). 89% vzorků bylo pozitivních na obsah fumonisinů v rozsahu 9 - 4594 ng/g (aritm. průměr 180 ng/g). U 4 % vyšetřovaných vzorků byly stanoveny koncentrace fumonisinů více než 1000 ng/g, u 10% vzorků více než 500 ng/g a u 38% vzorků koncentrace více než 100 ng/g. Kukuřičný křehký chléb, extrudované kukuřičné výrobky (křupky, tyčinky) a polenta patří k potravinám s vyššími stanovenými koncentracemi fumonisinů. Maximální koncentrace fumonisinů byly stanoveny ve vzorku kukuřičného křehkého chleba (4594 ng/g), extrudovaných kukuřičných výrobků (1178 ng/g) ve vzorku polenty (1243 ng/g). Corn flakes, pop corn, corn snack patří k potravinám, kde byly stanoveny poměrně nízké koncentace fumonisinů. Maximální hodnoty koncentrace fumonisinů činily ve vzorcích corn flakes 328 ng/g, pop cornu 128 ng/g a corn snacku 32 ng/g.

V řadě Evropských zemí byly potraviny na bázi kukuřice z obchodní sítě vyšetřovány na obsah fumonisinů a bylo dosaženo obdobných výsledků. Ostrý a Ruprich ⁽¹⁸⁾ vyšetřili v České republice 127 vzorků potravin pro bezlepkovou dietu. 88% potravin bylo pozitivních na obsah fumonisinů (FB₁, FB₂, FB₃). Nejvyšší koncentrace fumonisinů byla stanovena u extrudovaných kukuřičných výrobků (1808 ng/g).

Usleber et al. ⁽³²⁾ analyzoval 19 vzorků kukuřičných potravin z obchodní sítě v SRN. 84 % vzorků bylo kontaminováno FB₁, přesto většina vzorků obsahovala koncentraci méně než 100 ng/g. Maximální hodnota byla stanovena v polentě 1000 ng/g FB₁.

Doko a Visconti ⁽⁷⁾ publikovali výsledky stanovení FB₁ a FB₂ v kukuřici a potravinách na bázi kukuřice v Itálii. Všechny vzorky byly positivní v množství do 5310 ng/g u FB₁ a do 1480 ng/g u FB₂. Nejvyšší kontaminace fumonisiny byla zjištěna v extrudované kukuřici kontaminace 6100 ng/g FB₁ a 520 ng/g FB₂. Hodnoty v rozmezí 420 - 3760 ng/g FB₁ a 80 - 910 ng/g FB₂ byly stanoveny v mleté kukuřici, v kukuřičné mouce nebo v polentě. Všechny vzorky sladké kukuřice byly pozitivní na obsah FB₁ v rozmezí 60 - 790 ng/g, ale negativní na obsah FB₂. Nižší hodnoty fumonisinů byly nalezeny v popcornu (do 60 ng FB₁ /g a 20 ng FB₂/g), tortilla chips (do 60 ng FB₁ /g a 10 ng FB₂/g) a v cornflakes (10 ng FB₁/g).

Pittet et al. ⁽²⁰⁾ vyšetřili ve Švýcarsku potraviny na bázi kukuřice na obsah FB₁. Ve 44 vzorcích (36.7%) ze 120 bylo zjištěn obsah FB₁ (55 -790 ng/g). Nejvyšší frekvence pozitivních vzorků 61.8% a nejvyšší koncentrace FB₁ 790 ng/g byla nalezena v mleté kukuřici.

Zoller et al. ⁽³⁸⁾ testovali ve Švýcarsku 104 potravin na bázi kukuřice (corn-based foods) a potravin bez kukuřice (corn - free foods). V mleté kukuřici a v kukuřičné mouce byl zjištěn obsah FB₁ 406 ng/g (rozmezí 14 -3400 ng/g) a FB₂ 95 ng/g (5-900 ng/g). Všechny vzorky potravin bez kukuřice (corn - free foods) neobsahovali detekovatelné množství fumonisinů.

Sanchis et al. ⁽²³⁾ publikovali výsledky stanovení fumonisin B₁ a B₂ v 50 vzorcích potravin na bázi kukuřice (mletá kukuřice, corn flakes, snacks, kukuřičnou mouku a kukuřičné tousty) ze Španělska. Stanovené hodnoty kontaminace FB₁ byly velmi nízké s průměrnou hodnotou (mean ) 80 ng/g.

Vytvoření zdůvodněného a relevantními daty podloženého hygienického limitu je závislé na výsledcích v současné době probíhajících toxikologických studií a stanovení NOAEL nebo LOAEL pro toxikologicky nejvýznamnější efekt  ^{(11, 35)}. Ve Švýcarsku byl navržen administrativní hygienický limit pro obsah fumonisinů v kukuřičných výrobcích na 1000 ng/g ⁽³⁸⁾. Náš návrh předběžného administrativního hygienického limitu pro kukuřičné výrobky byl stanoven obdobně na úrovni 1000 ng/g pro sumu FB₁ a FB₂, aby se zamezil přístup vysoce kontaminovaných potravin ke spotřebiteli (v naší studii to představuje cca 4% vzorků). Koncentrace na úrovni hygienického limitu lze relativně snadno kontrolovat komerčními ELISA metodami a verifikovat metodou HPLC. ELISA je velmi dobrou alternativou pro kvantitativní screening fumonisinů v kukuřici a v potravinách ná bázi kukuřice ^{(24, 29, 32)}. Korelační koeficienty hodnocení výsledků fumonisinů v kukuřici (>1000ng/g), které byly analysované souběžně metodou ELISA a HPLC byly stanoveny v hodnotě následovně r = 0.996 ⁽²⁹⁾ a (r > 0.9, P < 0.05) ⁽²⁾. HPLC je však nejčastěji užívanou metodou stanovení fumonisinů ⁽²⁶⁾.

Odhad dietárního příjmu různých typů potravin na bázi kukuřice je vyjádřen v gramech na osobu a den ⁽²²⁾. Nejvyšší odhad expoziční dávky je možno očekávat z kukuřičné mouky 0.428 µg/osobu/den (aritm. průměr naměřených hodnot) a polenty 0.280 µg/osobu/den (aritm. průměr naměřených hodnot). Nižší odhady expoziční dávky fumonisinů je možno očekávat z pop cornu, corn snacku a cornflakes.

Zoller et al. ⁽³⁸⁾ odhadují prům. denní příjem fumonisinů ve Švýcarsku na 2µg /osobu/den.

Poděkování (Acknowledgements)

The authors of this paper would like to thank collegue Mrs. J. Jezova for their effective technical assistance.

Literatura

1. Abouzied, M.M., Pestka, J.J. 1994. Simultaneous Screening of Fumonisin B₁ and Zearalenone by Line Immunoblot: A Computer - Assisted Multianalyte Assay System. J. AOAC 77: 495-501.
2. Abouzied, M.M., Azcona-Oliveira , J.I., Hart, L.P., Pestka, J.J. 1996. Detection of fumonisins in Fusarium cultures, corn and corn products by polyclonal antibody - based ELISA - relation to fumonisin B-1 detection by liquid chromatography. J. Food Protect. 59: 645 - 651.
3. Azcona-Oliveira, J.I., Abouzied, M.M., Plattner, R.D., Pestka, J.J. 1992. Production of Monoclonal Antibodies to the Mycotoxins Fumonisin B₁, B₂ a B₃. J. Agri. Food Chem. 40:531 - 534.
4. Bullerman, L.B., Tsai, W.Y.J. 1994. Incidence and Levels of Fusarium moniliforme, Fusarium proliferatum a Fumonisins in Corn a Corn-Based Foods and Feeds. J. Food Protect. 57: 541 - 546.
5. Colvin, B.M. Harrison L.R. 1992. Fumonisin - induced pulmonary edema and hydrothorax in swine. Mycopathologia 117: 79 - 82.
6. Chu, F.S., Li,G.Y. 1994. Simultaneous occurrence of fumonisin B₁ and other mycotoxins in moldy corn collected from the Peoples' Republic of China in regions with high incidences of esophageal cancer. Appl. Environ. Microbiol. 60:847-852.
7. Doko M.B., Visconti, A. 1994. Occurrence of fumonisins B₁ and B₂ in corn and corn-based human foodstuffs in Italy. Food Additives and Contaminants 11: 433 - 439.
8. Gerderblom, W.C. A., Jaskiewicz, K. Marasas, W.F.O., Thiel, P.G., Horak, R.M. 1988. Fumonisins - Novel mycotoxins with cancer-promoting activity produced by Fusarium moniliforme. Appl. Environ. Microbiol. 54: 1806 -1811.
9. Gerderblom, W.C. A., Kriek, N.P.J., Marasas, W.F.O., Thiel, P.G. 1991. Toxicity and carcinogenity of the Fusarium moniliforme metabolite, fumonisin B₁ in rats. Carcinogenesis 12: 1247 - 1251.
10. Gerderblom, W.C.A., Marasas, W.F.O., Vleggaar R. et al. 1992. Fumonisins: Isolation, chemical charakterization and biological effects. Mycopathologia 117: 11 - 16.
11. Gerderblom, W.C.A., Smuts, C.M., Snyman, S.D., Cawood, M.E., Vanderwesthuizen, L., Swanevelder, S. 1996. Effect of fumonisin B-1 on protein and lipid synthesis in primary rat hepatocytes. Food Chem. Toxicol. 34 (4): 361-369.
12. Harrison, L.R., Colvin, B.M., Greene, J.T., Newman, L.E., Cole, J.R. 1990. Pulmonary edema and hydrothorax in swine produced by fumonisin B₁, a toxic metabolite of Fusarium moniliforme. J.Vet. Diagnost. Invest. 2: 217 - 221.
13. Mararas, W.F.O., Kellermann, T.S., Gelderblom, W.C.A., Coetzer, J.A.W., Thiel, P.G., van der Lugt, J.J. 1988. Leukoencephalomalacie in a horse induced by fumonisin B₁ isolated from Fusarium moniliforme. Onderstepoort J. Vet. Res. 55: 197 - 203.
14. Merrill A.H., Vanechten, G. , Wang, E. et al. 1993. Fumonisin-B(1) inhibits sphingosine (sphingamine) N-acyltransferase and de novo sphingolipids biosynthesis in cultured neurons in situ. J. Biol. Chem. 268: 27299 - 27306.
15. Nelson, P.E., Plattner, R.D., Shackelford, D.D. and Desjardins, A. E. 1992. Fumonisin B₁ production by Fusarium sp. other than F. moniliforme in section Liseola and by some related species. Appl. Environ. Microbiol. 58: 984 - 989.
16. Nelson, P.E., Desjardins and A. E Plattner, R.D. 1993. Fumonisins, mycotoxins produced by Fusarium species: biology, chemistry and significance. Annu. Rev. Phytopathol. 31: 233 -252.
17. Norred, W.P., Plattner, R.D., Vesonder, R.F., Bacon, C.W., and Voss, K.A. 1992. Effects of selected secondary metabolites of Fusarium moniliforme on unscheduled synthesis of DNA by rat primary hepatocytes. Food Chem. Toxicol. 30: 233 - 237. 
18. Ostrý, V., Ruprich, J. 1997. Determination of the mycotoxins fumonisins in gluten - free diet (corn - based commodities) in the Czech Republic. Centr. Eur. J. Publ. Hlth. In press
19. Osweiler, C.D., Ross, P.F., Wilson T.M., Nelson, P.E., Witte, S.T., Carson, T.L., Rice, L.G., Nelson, H.A. 1992. Characterization of an epizootic of pulmonary edema in swine associated with fumonisin in corn screenings.J. Vet. Diag. Invest 4: 53 -59.
20. Pittet, A., Parisod, V. and Schellenberg, M. 1992. Occurrence of fumonisin B₁ a B₂ in corn-based products from the Swiss market. J. of Agri. and Food Chem. 40: 1352 -1354.
21. Ross, P.F., Ledet, A.E., Owens, D.L. Rice, L.G., Nelson H.A., Osweiler, G.D., Wilson, T.M. 1993. Experimental equine leukoencephalomalacia, toxic hepatosis, and encephalopathy, caused by corn naturally contaminated with fumonisins. J.Vet. Diagn. Invest 5: 69 - 74. 
22. Ruprich, J. (ed.). 1997. The Food Basket for Czech Republic - 1994. In press.
23. Sanchis,V., Abadias, M., Oncins, L., Sala, N., Vinas, I., Canela,R. 1994. Occurrence of fumonisins B₁ and B₂ in corn-based products from the Spanish market. Appl. Environ. Microbiol. 60:2147-2148.
24. Schneider, E., Usleber, E., Martlbauer, E. 1995. Rapid detection of fumonisin B-1 in corn-based food by competitive direct dipstick enzyme immunoassay enzyme-linked immunofiltration assay with integrated negative control reaction. J. Agri. Food Chem. 43: 2548 - 2552.
25. Selim, M.I., Elsharkawy, S.H., Popendorf, W.J. 1996. Supercritical fluid extraction of fumonisin B-1 from grain dust. J. Agri. Food Chem. 44: 3224 - 3229.
26. Shephard, G.S. , Sydenham, E.W., Thiel, P.G., Marasas, W.F.O. 1990. Quantitative Determination of fumonisin B₁ and B₂ by High-Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detection. J. Liq. Chromatogr. 13: 2077 - 2087.
27. Shelby, R.A., Rottinghaus, G.E., Minor, H.C. 1994. Comparison of Thin-Layer Chromatography and Competitive Immunoassay Methods for Detecting Fumonisin on Maise. J. Agri. Food Chem. 42: 2064 - 2067.
28. Stack, M.E. and Eppley, R.M. 1992. Liquid chromatographic determination of fumonisin B₁ and B₂ in corn and corn products. J. AOAC Int. 75: 834 -837.
29. Sydenham, E.W., Shephard, G.S., Thiel, P.G., Bird C., Miller B.M. 1996. Determination of fumonisins in corn - evaluation of competitive immunoassay and HPLC technigues. J. Agri. Food Chem. 44: 159 - 164.
30. Sydenham, E.W., Thiel, P.G., Marasas, W.F.O., Shephard, G.S., van Schalkwyk, D.J., Koch, K.R. 1990. Natural occurence of some Fusarium mycotoxin in corn from low and high esophageal cancer prevalence areas of the Transkei, southern Africa. J. Agric. Food Chem. 38: 1900 -1903.
31. Sydenham, E.W., Shephard, G.S., Thiel, P.G., Marasas, W.F.O. 1991. Fumonisin contamination of commercial corn-based human foodstuffs. J. Agric. Food Chem. 39: 2014 - 2018.
32. Usleber, E., Straka, M., Terplan, G. 1994. Enzyme Immunoassay for Fumonisin B₁ to Corn-Based Food. J. Agri. Food Chem. 42: 1392 - 1396.
33. Van Egmond, H.P. 1995. Mycotoxins - regulations, quality assurance and reference materials. Food Additives & Contaminants. 12: 321 - 330.
34. Wang, E. , Ross, P.F., Wilson, T.M. et al. 1992. Increases in serum sphingosine and sphingamine and decreasas in complex sphingolipids in ponies given feed contaniing fumonisins, mycotoxins produced by Fusarium moniliforme. J. Nutr. 122: 1706 - 1716.
35. Wu, W.D., Liu, T.X., Vesonder, R.F. 1995. Comparative cytotoxicity of fumonisin B-1 and moniliformin in chicken primary cell cultures. Mycopathologia. 132: 111 - 116.
36. Yoshizawa,T., Yamashita, A., Luo,Y. 1994. Fumonisin occurrence in corn from high - and low-risk areas for human esophageal cancer in China. Appl. Environ. Microbiol. 60: 1626-1629.
37. Young, J.C., Lafontaine, P. 1993. Detection and characterization of fumonisins as their methyl esters by liquid chromatography/ particle - beam mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 7: 352 - 359.
38. Zoller,O., Sager, F., Zimmerli, B. 1994. Vorkommen von Fumonisinen in Lebensmitteln. Mitteilungen aus dem Gebiete der Lebensmitteluntersuchung und Hygiene 85 : 81-99. (In German)